明穆宗即位後啟用在藩邸的老師高拱、張居正。隆慶初年，位處執政之首的世宗舊臣徐階策動朝官彈劾高拱，高拱辭官回鄉。高拱亦不甘示弱，一年後策動朝官彈劾徐階。徐階也被迫正式退休。朝廷的實際政務漸漸落到了張居正的手上。隆慶末年，高拱回朝出任內閣首輔。隆慶朝名臣名將薈萃，陸上與蒙古達成和議，史稱俺答封貢；海上開放民間貿易，史稱隆慶開關；因為這兩項措施，明朝又重現中興氣象，史稱隆慶新政。

1572年，明穆宗因中風突然駕崩，年僅九歲的皇太子朱翊鈞繼位，改元萬歷。由於年幼由太後攝政，重臣高拱因與太後信任的宦官馮保對抗而被罷官，張居正則得到馮保的鼎力支持。張居正輔政十年，推行改革，在內政方面，推行考成法，裁撤政府機構中的冗官冗員，整頓郵傳和銓政。經濟上，清丈全國土地，抑制豪強地主，改革賦役制度，推行一條鞭法，減輕農民負擔。軍事上，加強武備整頓，平定西南騷亂，重用抗倭名將戚繼光總督薊、昌、保三鎮練兵鎮守長城，使邊境安然。張居正還啟用潘季馴治理黃河，變水患為水利。同時張居正嚴懲貪官汙吏，裁汰冗員。張居正整頓朝正，改革體制，史稱萬歷中興。

1577年秋，張居正父親去世，按常理他需要丁憂，但張居正以為改革事業未竟，不願丁憂。他的政敵借此大做文章，史稱奪情之爭。最後在明神宗和兩太後的力挺下張居正被奪情起覆，使得其改革並未被中斷。但是，這成為了他的政敵之借口。同時張居正利用職權讓親子通過科舉進入翰林院。張居正死後被反對改革的政敵清算。張府家屬被囚禁於內，餓死十餘口，生前官爵也被剝奪。

張居正死後初期，明神宗尚能保持對朝政的興趣，在位期間有東林黨爭、國本之爭等重大事件，對外有朝鮮之役與薩爾滸之戰。萬歷一朝成為明朝由盛轉衰的轉折期。

國本之爭主要圍繞著皇長子朱常洛與福王朱常洵。明神宗遲遲不立太子，令群臣憂心如焚。直到1601年，朱常洛才被封為太子，朱常洵被封為福王。但是福王遲遲不離京就任藩王。直到梃擊案發生，輿論對鄭貴妃不利後，福王才離京就藩。明神宗於國本之爭對大臣極度不滿，自1587年後，就開始連續不上朝作為報覆，僅處理一些重要事件。自1588年後，早朝也經常看不到他，整日在深宮中不理政事。

東林黨源於顧憲成組辦的東林書院。東林黨爭起因是內閣缺人，顧憲成極力主張頗有政績的淮揚巡撫李三才入閣，結果被反對李三才入閣的勢力抹黑漫罵，東林黨因此興起，朝中其它各黨便集中火力攻擊東林黨。閹黨專權後，東林黨更受到嚴重打擊，直到崇禎年間東林黨才重新被啟用。

1583年9月10日，利瑪竇與羅明堅進入中國，求得知府王泮的允許，在崇禧塔旁修建了一座帶有教堂的小房子，在肇慶建立了第一個傳教駐地，利瑪竇出版了第一份中文世界地圖，並用中文和羅明堅起草了第一部《祖傳天主十誡》。經過了幾次嘗試，利瑪竇和羅明堅沒能建立起新的駐地，羅明堅被教皇召回羅馬安排教皇使節去見中國皇帝，而利瑪竇和麥安東神父繼續留在肇慶。

1584年利瑪竇獲準與羅明堅神父入居廣東肇慶。他們對中國官員自稱來自“天竺”，致使中國人以為他們是佛教徒。利瑪竇解釋來中國的原因：“我們是從遙遠的西方而來的教士，因為仰慕中國，希望可以留下，至死在這裏侍奉天主。”他不敢直接回答傳教的目的，否則他可能會被驅逐。為了傳教，他們從西方帶來了許多用品，比如聖母像、地圖、星盤和三棱鏡等。其中還有歐幾裏德《幾何原本》。利瑪竇帶來的各種西方的新事物，吸引了眾多好奇的中國人。特別是他帶來的地圖，令中國人眼界大開。

進入了中國的利瑪竇對中國文明非常稱讚：除了還沒有沐浴“我們神聖的天主教信仰”之外，“中國的偉大乃是舉世無雙的”“中國不僅是一個王國，中國其實就是一個世界。”他感嘆“柏拉圖在《共和國》中作為理論敘述的理想，在中國已被付諸實踐。”而且他還發現中國人非常博學，“醫學、自然科學、數學、天文學都十分精通。”但是他也發現“在中國人之間科學不大成為研究對象。”

1584年8月，利瑪竇在肇慶建立了“仙花寺”，開始傳教工作。起初傳教十分低調。神父們行事小心謹慎，主要精力都在學習漢語和中國的禮節習俗，以博得中國人尤其是官員們的信任。他們身穿佛教僧侶的服飾，認為這樣能夠博得人們的好感，而且他們也覺得這與天主教神父的裝束相差不大。這也使中國人更加相信他們是遠道而來的僧人。他們在這裏掛上了聖母瑪利亞的畫像，許多士人官吏，甚至僧人都來跪拜，他們感到非常興奮。但是從中國人的角度來講這更多是出於禮節性的，而沒有宗教意義。也有記述說，他們擔心中國人看到瑪利亞的畫像會誤認為他們的神是女性的，而改掛了基督像。

1584年利瑪竇制作並印行《山海輿地全圖》，這是中國人首次接觸到了近代地理學知識。利瑪竇利用解釋各種西方事物的機會，同時介紹了他們的天主教信仰。他們翻譯了《十誡》、《主的祈禱》、《聖母讚歌》和《教理問答書》。並派發羅明堅撰寫的《天主實錄》，以中文解釋天主教的教義。利瑪竇在肇慶居住六年，除帶來了歐洲文藝覆興的成果外，系統地學習了中國傳統文化，期間傳入的現代數學、幾何、世界地圖、西洋樂等西方文明。

1589年夏天，即萬歷十七年，廣東新任總督把傳教士驅逐出肇慶。1590年，利瑪竇奉範禮安之命起草一封以教宗名義致大明皇帝的信劄，其中亦稱教宗西師都五世(1585-1590)乃居住在“天竺國”的“都僧皇”，因期盼能傳“天主正教”，“推廣慈悲，普濟世人”，特遣“博雅儒僧”四出揚教，並派“德行頗優，儒文宏博”的“上僧”等四人入華，希望明帝能對此四僧“給有劄牒，沿途迎送，以華其行”。經過多方努力，利瑪竇得以被派往韶州，在那兒他建立了第二個傳教駐地。在韶州的時候，利瑪竇遇到了一次意外。他們遇上了強盜打劫，雖然利瑪竇受了一點傷，但是幸好他們嚇退了強盜，而且很快這些強盜就被逮捕歸案。在韶州期間，另外一個不幸是利瑪竇的兩名部下相繼逝世。

1591年麥安東神父逝世。1592年初春，利瑪竇前往南雄拜訪瞿汝夔（瞿太素），瞿氏即力勸利氏蓄須留發，且脫去僧服改穿儒服，他更透過其人脈網絡，努力將利瑪竇引介入士大夫的交游圈中。

1593年石方西神父也辭世了。而另外一名羅明堅神父則早已返回了歐洲，只剩下利瑪竇一人從事在中國的傳教事業。感到欣慰的是，他在肇慶結識的士人瞿太素成為了他的好友和弟子，還幫助利瑪竇翻譯了歐幾裏得《幾何原本》的第一卷。藉著瞿太素的宣傳，以及贈送高官們利瑪竇自己制作的天體儀、地球儀和計時用的日晷等西洋物品，利瑪竇的名聲逐漸在當地的達官貴人中傳開。

在韶州他攻讀《四書》，並首次將之譯為拉丁文。而通過與瞿太素和其他許多中國上流社會人士的接觸，利瑪竇發現自己先前的佛教僧侶裝扮在當時的中國社會並不受到尊重，社會地位也比較低下。為了更方便與中國的官員交往，在征得範禮安的同意後，從1594年起，利瑪竇開始蓄發留須，並穿起了當時儒士的服裝。

1594年，利瑪竇和中國的一名被派遣到朝鮮邊境的將軍一起，初步嘗試進入北京。但到達南京，又不得不返回駐地。1595年（萬歷二十三年）利瑪竇借口為一位北上任職官員之子治病，而獲得了去南京的機會。但是到了南京以後，利瑪竇陪同的官員對他逐漸失去了興趣，利瑪竇只好自己設法留在南京。

然而這一次失敗了。他只好折返南昌，並獲得批準在此居住並建立了第三個傳教駐地。明朝王室成員、各級官員都對地球儀、玻璃器皿、西式裝訂的書籍等禮物極感興趣，利瑪竇便在自己的住宅再一次舉行“科普”展覽，表演先進的記憶方法，出版《交友論》，並開始撰寫《天主實義》，選擇適合中國人倫理觀的西方偉人語錄加以刊行。他放棄建造教堂，公開傳教的方法，進一步用中國自古就有的“上帝”偷換“天主”概念。

利瑪竇在南昌傳教的三年，也是他的傳教策略在探索和實踐中逐步形成的過程。他與江西的官紳階層進行了密切交往和友好的對話，並在這個過程中形成了一套成功的傳教策略——“南昌傳教模式”。

他在寫給耶穌會的報告中解釋了在南昌傳教成功的原因：一是因為當地從沒有見過外國人；二是利瑪竇的記憶力非常好，以至於許多中國人都想學習，他也因此用漢語寫了一本《西國記法》的書來介紹他的記憶方法；三是它能夠運用四書五經來宣講基督教的教義；四是他的自然科學知識；五是傳說他會煉金術；六是有人向他求教基督教。

1596年利瑪竇被範禮安任命為耶穌會中國教區的負責人，由利瑪竇全權負責在中國的傳教活動。並且指示利瑪竇想辦法到北京去覲見中國的皇帝，以達到在中國傳教的有力保障。而且還從澳門送去了許多準備送給中國皇帝的禮物。在南昌，利瑪竇知遇了江西巡撫陸萬垓，向他展示三棱鏡、西國記數法和鐘，並講解西方書籍的內容，他還向當地學人講解數學問題與日晷記時問題。

1596年9月22日利瑪竇在這裏成功的預測了一次日食，使他很快成為了一個有名的人物。期間結交了許多儒士權貴，受當時名士章潢之邀在著名的白鹿洞書院講學交流，與分封在南昌的皇族後裔建安王和樂安王建立了友好的關系等等。1597年，利瑪竇被任命為中國傳教的主管。

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